導讀

       近年來，大分子生物藥（單抗，雙抗，ADC以及干擾素）研發熱潮一浪高過一浪，這并不代表小分子藥物市場的衰退，恰恰相反，小分子藥物因其獨特的優勢（可以靶向胞內胞外，研發成本相對較低，工藝相對熟練），依然是新藥研發的主戰場。從2020年FDA批準了53個新藥，而小分子新藥占了38個這個數據就可證實。此外，小分子藥在生物藥沖擊的浪潮之下，并沒有固步自封，閉門造車，而是不斷更新技術。如圖1，各種蛋白降解技術（PPOTACs、LYTACs、Molecular Glue、AUTAC等）作為新興小分子藥物研發的一個利器，引領創新藥風向從傳統藥物靶標（占人體靶點約20%）轉向更具挑戰性的“不可成藥”靶標（占人體靶點約80%）。

圖1 蛋白降解技術簡圖⁵

       細胞在維持體內環境穩態的過程中，需要將細胞代謝、營養感知、質膜修復、分泌過程以及應激等病理過程產生的“廢料”清除，而清除的過程中需要用到的兩大蛋白質和細胞器降解系統分別是：泛素-蛋白酶體系統，溶酶體系統。大部分蛋白降解技術都是圍繞著這兩個體系發展延伸的，讓小0帶領大家一起學習各種蛋白降解技術吧。

泛素-蛋白酶體系統

         基于泛素-蛋白酶體系統的PROTAC技術和分子膠技術是蛋白降解技術發展的“雙子星”。相比其他還處于發展中的技術，這兩項技術的發展以及遙遙領先。

1PROTAC技術

       蛋白降解靶向嵌合體PROTAC是一種雜合雙功能多肽或小分子化合物，PROTACs分子量一般在700~1200之間。其結構類似于啞鈴，一端是泛素連接酶E3配體，另一端是與細胞中目標靶蛋白結合的配體（POI），兩端之間通過Linker相連，從而形成“三體”聚合物—靶蛋白配體-Linker-E3配體。如圖2，E3泛素連接酶可通過將一種叫做泛素的小蛋白“粘貼”在靶蛋白上，將靶蛋白標記為缺陷或受損蛋白，然后，利用細胞內在的蛋白“粉碎機”（即26S蛋白酶體）可以識別和降解被標記的靶蛋白。簡而言之，就是標靶蛋白被打上泛素化標簽-被識別-被降解。

圖2 PROTAC作用機制（網圖）

PROTAC新興技術很多，以下簡單介紹幾種有代表性的PROTACs:

       光控PROTAC：Trauner課題組開發一種光控的蛋白質降解技術（PHOTAC），通過將偶氮苯結構作為光開關，引入到PROTAC分子結構中，從而實現光誘導的靶蛋白降解。
       抗體-PROTAC偶聯物：Tate課題組將PROTAC概念應用到抗體偶聯藥物的設計中，通過將曲妥珠單抗與PROTAC進行偶聯，選擇性降解HER2陽性細胞的溴結構域蛋白4（BRD4），從而實現PROTAC技術的細胞特異性。

       抗體類AbTAC：如圖1，AbTAC也通過內吞-溶酶體途徑誘導胞外蛋白和膜蛋白的降解，因此AbTAC雖然冠PROTAC之名，但與LYTAC的關系更為密切。AbTAC本質上是一個重組的雙特異性抗體，一個臂靶向細胞表面的目標蛋白，一個臂靶向跨膜的E3連接酶，例如RNF43(RNF43是一個單次跨膜的E3連接酶，包含膜外結構域，跨膜結構域和RING細胞內結構域)，從而引起三元復合物的內吞和溶酶體降解。第一個AbTAC由加州大學舊金山分校的Wells課題組開發，通過重組雙特異性抗體成功將腫瘤細胞表面的PD-L1分子成功引導到溶酶體降解。相對LYTAC，AbTAC能降低嵌合體分子的免疫原性，但其是否可以回收再利用等具體機制還有待研究。

       納米抗體GlueTAC:北京大學的陳鵬課題組首次報道了基于納米抗體構建的GlueTAC技術。如圖3，研究人員對天然的納米抗體進行了改造，在納米抗體CDR3的結合區域引入了一個非天然氨基酸（紅色火柴頭），這使得改造后的納米抗體和靶蛋白形成共價鍵的牢固結合，一旦和靶蛋白形成特異性結合后，很難再解離。改造后的納米抗體被命名為Glueody（淺藍色）。為了提高內吞效率的穩定性研究人員在Gluebody上耦連（Sortase A介導的蛋白耦連）了CPP-LSS多肽（CPP淺灰色、LSS深藍色）。

 

圖3 GlueTAC作用機制¹

分子膠Molecular Glue技術

       分子膠通過修飾泛素化連接酶表面進行改性，從而識別并降解目標蛋白。與PROTAC類似，分子膠技術也可以引起靶蛋白的泛素化和降解。與PROTAC不同的是分子膠是小分子量化合物，并且能夠作用于沒有小分子結合口袋的不可成藥靶點（注：人體細胞中~80%蛋白沒有小分子結合口袋）。

雙機制降解劑技術

       雙機制降解劑(Double-mechanism degrader)則是單一分子可分別扮演PROTAC和分子膠的角色，誘導兩種目標蛋白的降解，有提升治療效果的潛力。清華大學藥學院的饒燏教授團隊開發了一種代號GBD-9的小分子，其可以作為PROTAC促進BTK降解，也可以作為分子膠促進翻譯終止因子GSPT1的降解。在多種癌細胞系中顯示出比小分子BTK抑制劑依魯替尼更強的抗腫瘤作用，有可能克服BTK抑制劑無法治療的彌漫性大B細胞淋巴瘤以及急性髓細胞白血病。

溶酶體系統

       溶酶體是一種酸性細胞器，通過內吞和自噬作用從質膜或細胞質中接收物質，并將其降解和循環利用。內吞的物質被結合，并通過早期的內體、內體載體小泡、晚期的內體和溶酶體進行隨后的水解。自噬途徑始于一種被稱為吞噬載體的孤立的膜結構，該結構來源于脂質雙層和脂化的LC3蛋白。這種吞噬體會膨脹，吞噬細胞內的貨物(自噬底物)，包括蛋白質和其他生物分子，甚至細胞器，從而將它們隔離在一個叫做自噬小體的雙層小泡中。裝載的自噬體會隨著蛋白的降解而成熟。因此，內體/溶酶體途徑和自噬途徑都能夠降解靶物質。如圖4，LYTAC、ATTEC和AUTAC技術是目前進展較快的溶酶體體系蛋白降解劑。

 

圖4 溶酶體系統的蛋白降解技術²

內吞-溶酶體途徑

       內吞-溶酶體途徑主要負責胞外蛋白與跨膜蛋白的降解，在細胞的營養攝取、信號傳遞、抗原呈遞和儲存等過程中發揮著重要作用。溶酶體靶向嵌合體LYTAC技術利用內吞-溶酶體途徑，有效地實現胞外蛋白和膜蛋白的降解。

       如圖4A，LYTAC主要由兩個結合域組成，其中一個是靶向細胞表面的溶酶體靶向受體LTR（lysosome-targeting receptor）的寡聚糖結構，另一個是靶向靶蛋白的抗體、多肽或小分子，兩者通過一個Linker連接在一起。目前已報道的溶酶體靶向受體主要有兩種，分別是非陽離子依賴型20-或90-聚體的甘露糖-6-磷酸受體（cation-independent mannose-6-phosphate receptor，CI-M6PR）和去唾液酸糖蛋白受體（asialoglycoprotein receptor，ASGPR）（圖5）。LYTAC與PROTAC不同，PROTAC通過蛋白酶體降解靶蛋白，通常適用于細胞內蛋白。而LYTAC可以通過細胞膜表面的溶酶體靶向受體誘導蛋白質向溶酶體遷移，因而也可以靶向細胞外蛋白和跨膜蛋白，且不依賴于泛素化和蛋白酶體。

 

圖5 LYTAC的兩種受體形式³

       雙特異性核酸適體嵌合體(Bispecific aptamer chimera)和LYTAC類似，也通過內吞-溶酶體途徑介導目標蛋白降解。但其化學本質與LYTAC不同，其由兩個分別靶向目標蛋白和LTR的核酸適體偶聯得到，也是通過與LTR及目標蛋白形成三元復合物內吞來降解目標蛋白。上海交通大學的韓達報道了第一個雙特異性核酸適體嵌合體，實現了對間質表皮轉化因子c-Met和酪氨酸蛋白激酶7的快速降解，在抗腫瘤方面有較好的開發潛力。相較于LYTAC，雙特異性核酸適體嵌合體有制備更為簡單、連接方式確定、穩定性更好的優點。

自噬-溶酶體途徑

       自噬是細胞清除自身受損或無用蛋白質或細胞器，維持細胞的穩態和正常生命活動的重要過程。利用自噬途徑開發的蛋白質降解技術主要有AUTEC、ATTEC及基于CMA的嵌合體技術。

       如圖4B，自噬體束縛化合物AUTAC主要由3部分組成，分別是靶蛋白的靶向配體、Linker和降解標簽鳥嘌呤衍生物（GD）。AUTAC的作用原理是通過降解標簽模擬S-鳥苷酸化修飾，誘導靶蛋白的多聚泛素化，進而招募自噬體實現溶酶體途徑降解。AUTAC與PROTAC相似，也是通過誘導靶蛋白的多聚泛素化實現蛋白質降解，但是AUTAC分子不是將POI拴在E3連接酶亞單位上并觸發K48多泛素化，而是觸發K63多泛素化，K63多泛素化被選擇性的自噬途徑識別，導致靶POI的降解，因此具有更加廣泛的降解范圍，不僅可以降解細胞質蛋白，還可以實現降解個頭較大的細胞器，包括內質網、線粒體和過氧化物酶體等。

       如圖4C，ATTEC即自噬小體綁定化合物，該化合物可同時作用于靶蛋白和自噬小體蛋白LC3，從而拉近靶蛋白與LC3之間距離，實現兩者的捆綁。LC3可進一步誘導自噬泡包裹靶蛋白，形成自噬小體，隨后將自噬小體運輸到溶酶體，從而實現靶蛋白的降解。ATTEC可以與關鍵的自噬蛋白LC3和致病蛋白（如圖突變mHTT蛋白）特異性結合，而不與正常蛋白結合，并且可以將病原性材料包裝到自噬體中進行降解。ATTEC分子通過直接與自噬蛋白LC3相互作用，繞過泛素化過程，具有很大的潛力降解不同類型的靶標，包括自噬識別的非蛋白質貨物，如DNA/RNA分子，受損的細胞器等。一些ATTEC分子能夠通過血腦屏障，并在約100 nm的濃度下發揮作用，這為藥物發現提供了別致的切入點。

       同樣通過繞過泛素化過程與自噬蛋白結合的還有自噬靶向嵌合體AUTOTAC分子（圖1），該分子由三部分組成：目標蛋白的配體、linker、可啟動自噬的p62蛋白的配體。AUTOTAC同時結合目標蛋白和p62的ZZ結構域，并促進p62的寡聚化和活化，使目標蛋白降解。AUTOTAC不僅可以介導雄激素受體等單體蛋白的靶向降解，還能介導與阿爾茲海默相關的聚集性Tau蛋白的降解，這一點便是AUTOTAC相比PROTAC的優勢所在，為蛋白降解領域提供了一個針對聚集性蛋白的新策略。

 

圖6 AUTOTAC工作機制⁶

       如圖7，CMA嵌合體是利用CMA機制設計的一類雙功能分子，主要是嵌合多肽。首先，蛋白HSP70的復合物識別靶蛋白的KFERQ基序，與靶蛋白形成大復合物；隨后，該大復合物與溶酶體相關膜蛋白2A（LAMP2A）相互作用，LAMP-2A經過多聚合、底物異位最終實現溶酶體自噬降解。

 

圖7 CMA作用機制⁴

表1^2,5各種蛋白降解劑對比

總結

       目前，蛋白降解療法已成為備受醫藥企業青睞的研發方向之一。其中發展最快的是分子膠和PROTAC技術，BMS的分子膠來那度胺年銷售額已達128.91億美元，Arvinas的PROTAC分子ARV-471今年將啟動III期臨床，基于溶酶體的靶向降解發展時間較短，目前仍處于臨床前階段。隨著科學的進步和技術的發展，蛋白降解療法可以取得更多突破性的進展，研發出更多First-in-class藥物，早日造福廣大患者。

       蛋白降解技術雖然熱門，但是仍然存在很多疑問，小O淺談幾點：

       1. LYTAC目前主要是大分子，如何變成小分子，怎么解決高聚合度大分子量導致的體內代謝困難問題？

       2. AUTAC導致靶蛋白K63泛素化的機制是什么？

       3. ATTEC與LC3結合的結構生物學基礎是什么？

       4. PROTAC依賴特定幾個E3泛素化連接酶的表達以及蛋白酶體介導的降解，如何走出局限發展新技術？