導(dǎo)讀

       近年來，大分子生物藥（單抗，雙抗，ADC以及干擾素）研發(fā)熱潮一浪高過一浪，這并不代表小分子藥物市場的衰退，恰恰相反，小分子藥物因其獨特的優(yōu)勢（可以靶向胞內(nèi)胞外，研發(fā)成本相對較低，工藝相對熟練），依然是新藥研發(fā)的主戰(zhàn)場。從2020年FDA批準(zhǔn)了53個新藥，而小分子新藥占了38個這個數(shù)據(jù)就可證實。此外，小分子藥在生物藥沖擊的浪潮之下，并沒有固步自封，閉門造車，而是不斷更新技術(shù)。如圖1，各種蛋白降解技術(shù)（PPOTACs、LYTACs、Molecular Glue、AUTAC等）作為新興小分子藥物研發(fā)的一個利器，引領(lǐng)創(chuàng)新藥風(fēng)向從傳統(tǒng)藥物靶標(biāo)（占人體靶點約20%）轉(zhuǎn)向更具挑戰(zhàn)性的“不可成藥”靶標(biāo)（占人體靶點約80%）。

圖1 蛋白降解技術(shù)簡圖⁵

       細胞在維持體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的過程中，需要將細胞代謝、營養(yǎng)感知、質(zhì)膜修復(fù)、分泌過程以及應(yīng)激等病理過程產(chǎn)生的“廢料”清除，而清除的過程中需要用到的兩大蛋白質(zhì)和細胞器降解系統(tǒng)分別是：泛素-蛋白酶體系統(tǒng)，溶酶體系統(tǒng)。大部分蛋白降解技術(shù)都是圍繞著這兩個體系發(fā)展延伸的，讓小0帶領(lǐng)大家一起學(xué)習(xí)各種蛋白降解技術(shù)吧。

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)

         基于泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的PROTAC技術(shù)和分子膠技術(shù)是蛋白降解技術(shù)發(fā)展的“雙子星”。相比其他還處于發(fā)展中的技術(shù)，這兩項技術(shù)的發(fā)展以及遙遙領(lǐng)先。

1PROTAC技術(shù)

       蛋白降解靶向嵌合體PROTAC是一種雜合雙功能多肽或小分子化合物，PROTACs分子量一般在700~1200之間。其結(jié)構(gòu)類似于啞鈴，一端是泛素連接酶E3配體，另一端是與細胞中目標(biāo)靶蛋白結(jié)合的配體（POI），兩端之間通過Linker相連，從而形成“三體”聚合物—靶蛋白配體-Linker-E3配體。如圖2，E3泛素連接酶可通過將一種叫做泛素的小蛋白“粘貼”在靶蛋白上，將靶蛋白標(biāo)記為缺陷或受損蛋白，然后，利用細胞內(nèi)在的蛋白“粉碎機”（即26S蛋白酶體）可以識別和降解被標(biāo)記的靶蛋白。簡而言之，就是標(biāo)靶蛋白被打上泛素化標(biāo)簽-被識別-被降解。

圖2 PROTAC作用機制（網(wǎng)圖）

PROTAC新興技術(shù)很多，以下簡單介紹幾種有代表性的PROTACs:

       光控PROTAC：Trauner課題組開發(fā)一種光控的蛋白質(zhì)降解技術(shù)（PHOTAC），通過將偶氮苯結(jié)構(gòu)作為光開關(guān)，引入到PROTAC分子結(jié)構(gòu)中，從而實現(xiàn)光誘導(dǎo)的靶蛋白降解。
       抗體-PROTAC偶聯(lián)物：Tate課題組將PROTAC概念應(yīng)用到抗體偶聯(lián)藥物的設(shè)計中，通過將曲妥珠單抗與PROTAC進行偶聯(lián)，選擇性降解HER2陽性細胞的溴結(jié)構(gòu)域蛋白4（BRD4），從而實現(xiàn)PROTAC技術(shù)的細胞特異性。

       抗體類AbTAC：如圖1，AbTAC也通過內(nèi)吞-溶酶體途徑誘導(dǎo)胞外蛋白和膜蛋白的降解，因此AbTAC雖然冠PROTAC之名，但與LYTAC的關(guān)系更為密切。AbTAC本質(zhì)上是一個重組的雙特異性抗體，一個臂靶向細胞表面的目標(biāo)蛋白，一個臂靶向跨膜的E3連接酶，例如RNF43(RNF43是一個單次跨膜的E3連接酶，包含膜外結(jié)構(gòu)域，跨膜結(jié)構(gòu)域和RING細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域)，從而引起三元復(fù)合物的內(nèi)吞和溶酶體降解。第一個AbTAC由加州大學(xué)舊金山分校的Wells課題組開發(fā)，通過重組雙特異性抗體成功將腫瘤細胞表面的PD-L1分子成功引導(dǎo)到溶酶體降解。相對LYTAC，AbTAC能降低嵌合體分子的免疫原性，但其是否可以回收再利用等具體機制還有待研究。

       納米抗體GlueTAC:北京大學(xué)的陳鵬課題組首次報道了基于納米抗體構(gòu)建的GlueTAC技術(shù)。如圖3，研究人員對天然的納米抗體進行了改造，在納米抗體CDR3的結(jié)合區(qū)域引入了一個非天然氨基酸（紅色火柴頭），這使得改造后的納米抗體和靶蛋白形成共價鍵的牢固結(jié)合，一旦和靶蛋白形成特異性結(jié)合后，很難再解離。改造后的納米抗體被命名為Glueody（淺藍色）。為了提高內(nèi)吞效率的穩(wěn)定性研究人員在Gluebody上耦連（Sortase A介導(dǎo)的蛋白耦連）了CPP-LSS多肽（CPP淺灰色、LSS深藍色）。

 

圖3 GlueTAC作用機制¹

分子膠Molecular Glue技術(shù)

       分子膠通過修飾泛素化連接酶表面進行改性，從而識別并降解目標(biāo)蛋白。與PROTAC類似，分子膠技術(shù)也可以引起靶蛋白的泛素化和降解。與PROTAC不同的是分子膠是小分子量化合物，并且能夠作用于沒有小分子結(jié)合口袋的不可成藥靶點（注：人體細胞中~80%蛋白沒有小分子結(jié)合口袋）。

雙機制降解劑技術(shù)

       雙機制降解劑(Double-mechanism degrader)則是單一分子可分別扮演PROTAC和分子膠的角色，誘導(dǎo)兩種目標(biāo)蛋白的降解，有提升治療效果的潛力。清華大學(xué)藥學(xué)院的饒燏教授團隊開發(fā)了一種代號GBD-9的小分子，其可以作為PROTAC促進BTK降解，也可以作為分子膠促進翻譯終止因子GSPT1的降解。在多種癌細胞系中顯示出比小分子BTK抑制劑依魯替尼更強的抗腫瘤作用，有可能克服BTK抑制劑無法治療的彌漫性大B細胞淋巴瘤以及急性髓細胞白血病。

溶酶體系統(tǒng)

       溶酶體是一種酸性細胞器，通過內(nèi)吞和自噬作用從質(zhì)膜或細胞質(zhì)中接收物質(zhì)，并將其降解和循環(huán)利用。內(nèi)吞的物質(zhì)被結(jié)合，并通過早期的內(nèi)體、內(nèi)體載體小泡、晚期的內(nèi)體和溶酶體進行隨后的水解。自噬途徑始于一種被稱為吞噬載體的孤立的膜結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)來源于脂質(zhì)雙層和脂化的LC3蛋白。這種吞噬體會膨脹，吞噬細胞內(nèi)的貨物(自噬底物)，包括蛋白質(zhì)和其他生物分子，甚至細胞器，從而將它們隔離在一個叫做自噬小體的雙層小泡中。裝載的自噬體會隨著蛋白的降解而成熟。因此，內(nèi)體/溶酶體途徑和自噬途徑都能夠降解靶物質(zhì)。如圖4，LYTAC、ATTEC和AUTAC技術(shù)是目前進展較快的溶酶體體系蛋白降解劑。

 

圖4 溶酶體系統(tǒng)的蛋白降解技術(shù)²

內(nèi)吞-溶酶體途徑

       內(nèi)吞-溶酶體途徑主要負責(zé)胞外蛋白與跨膜蛋白的降解，在細胞的營養(yǎng)攝取、信號傳遞、抗原呈遞和儲存等過程中發(fā)揮著重要作用。溶酶體靶向嵌合體LYTAC技術(shù)利用內(nèi)吞-溶酶體途徑，有效地實現(xiàn)胞外蛋白和膜蛋白的降解。

       如圖4A，LYTAC主要由兩個結(jié)合域組成，其中一個是靶向細胞表面的溶酶體靶向受體LTR（lysosome-targeting receptor）的寡聚糖結(jié)構(gòu)，另一個是靶向靶蛋白的抗體、多肽或小分子，兩者通過一個Linker連接在一起。目前已報道的溶酶體靶向受體主要有兩種，分別是非陽離子依賴型20-或90-聚體的甘露糖-6-磷酸受體（cation-independent mannose-6-phosphate receptor，CI-M6PR）和去唾液酸糖蛋白受體（asialoglycoprotein receptor，ASGPR）（圖5）。LYTAC與PROTAC不同，PROTAC通過蛋白酶體降解靶蛋白，通常適用于細胞內(nèi)蛋白。而LYTAC可以通過細胞膜表面的溶酶體靶向受體誘導(dǎo)蛋白質(zhì)向溶酶體遷移，因而也可以靶向細胞外蛋白和跨膜蛋白，且不依賴于泛素化和蛋白酶體。

 

圖5 LYTAC的兩種受體形式³

       雙特異性核酸適體嵌合體(Bispecific aptamer chimera)和LYTAC類似，也通過內(nèi)吞-溶酶體途徑介導(dǎo)目標(biāo)蛋白降解。但其化學(xué)本質(zhì)與LYTAC不同，其由兩個分別靶向目標(biāo)蛋白和LTR的核酸適體偶聯(lián)得到，也是通過與LTR及目標(biāo)蛋白形成三元復(fù)合物內(nèi)吞來降解目標(biāo)蛋白。上海交通大學(xué)的韓達報道了第一個雙特異性核酸適體嵌合體，實現(xiàn)了對間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子c-Met和酪氨酸蛋白激酶7的快速降解，在抗腫瘤方面有較好的開發(fā)潛力。相較于LYTAC，雙特異性核酸適體嵌合體有制備更為簡單、連接方式確定、穩(wěn)定性更好的優(yōu)點。

自噬-溶酶體途徑

       自噬是細胞清除自身受損或無用蛋白質(zhì)或細胞器，維持細胞的穩(wěn)態(tài)和正常生命活動的重要過程。利用自噬途徑開發(fā)的蛋白質(zhì)降解技術(shù)主要有AUTEC、ATTEC及基于CMA的嵌合體技術(shù)。

       如圖4B，自噬體束縛化合物AUTAC主要由3部分組成，分別是靶蛋白的靶向配體、Linker和降解標(biāo)簽鳥嘌呤衍生物（GD）。AUTAC的作用原理是通過降解標(biāo)簽?zāi)MS-鳥苷酸化修飾，誘導(dǎo)靶蛋白的多聚泛素化，進而招募自噬體實現(xiàn)溶酶體途徑降解。AUTAC與PROTAC相似，也是通過誘導(dǎo)靶蛋白的多聚泛素化實現(xiàn)蛋白質(zhì)降解，但是AUTAC分子不是將POI拴在E3連接酶亞單位上并觸發(fā)K48多泛素化，而是觸發(fā)K63多泛素化，K63多泛素化被選擇性的自噬途徑識別，導(dǎo)致靶POI的降解，因此具有更加廣泛的降解范圍，不僅可以降解細胞質(zhì)蛋白，還可以實現(xiàn)降解個頭較大的細胞器，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和過氧化物酶體等。

       如圖4C，ATTEC即自噬小體綁定化合物，該化合物可同時作用于靶蛋白和自噬小體蛋白LC3，從而拉近靶蛋白與LC3之間距離，實現(xiàn)兩者的捆綁。LC3可進一步誘導(dǎo)自噬泡包裹靶蛋白，形成自噬小體，隨后將自噬小體運輸?shù)饺苊阁w，從而實現(xiàn)靶蛋白的降解。ATTEC可以與關(guān)鍵的自噬蛋白LC3和致病蛋白（如圖突變mHTT蛋白）特異性結(jié)合，而不與正常蛋白結(jié)合，并且可以將病原性材料包裝到自噬體中進行降解。ATTEC分子通過直接與自噬蛋白LC3相互作用，繞過泛素化過程，具有很大的潛力降解不同類型的靶標(biāo)，包括自噬識別的非蛋白質(zhì)貨物，如DNA/RNA分子，受損的細胞器等。一些ATTEC分子能夠通過血腦屏障，并在約100 nm的濃度下發(fā)揮作用，這為藥物發(fā)現(xiàn)提供了別致的切入點。

       同樣通過繞過泛素化過程與自噬蛋白結(jié)合的還有自噬靶向嵌合體AUTOTAC分子（圖1），該分子由三部分組成：目標(biāo)蛋白的配體、linker、可啟動自噬的p62蛋白的配體。AUTOTAC同時結(jié)合目標(biāo)蛋白和p62的ZZ結(jié)構(gòu)域，并促進p62的寡聚化和活化，使目標(biāo)蛋白降解。AUTOTAC不僅可以介導(dǎo)雄激素受體等單體蛋白的靶向降解，還能介導(dǎo)與阿爾茲海默相關(guān)的聚集性Tau蛋白的降解，這一點便是AUTOTAC相比PROTAC的優(yōu)勢所在，為蛋白降解領(lǐng)域提供了一個針對聚集性蛋白的新策略。

 

圖6 AUTOTAC工作機制⁶

       如圖7，CMA嵌合體是利用CMA機制設(shè)計的一類雙功能分子，主要是嵌合多肽。首先，蛋白HSP70的復(fù)合物識別靶蛋白的KFERQ基序，與靶蛋白形成大復(fù)合物；隨后，該大復(fù)合物與溶酶體相關(guān)膜蛋白2A（LAMP2A）相互作用，LAMP-2A經(jīng)過多聚合、底物異位最終實現(xiàn)溶酶體自噬降解。

 

圖7 CMA作用機制⁴

表1^2,5各種蛋白降解劑對比

總結(jié)

       目前，蛋白降解療法已成為備受醫(yī)藥企業(yè)青睞的研發(fā)方向之一。其中發(fā)展最快的是分子膠和PROTAC技術(shù)，BMS的分子膠來那度胺年銷售額已達128.91億美元，Arvinas的PROTAC分子ARV-471今年將啟動III期臨床，基于溶酶體的靶向降解發(fā)展時間較短，目前仍處于臨床前階段。隨著科學(xué)的進步和技術(shù)的發(fā)展，蛋白降解療法可以取得更多突破性的進展，研發(fā)出更多First-in-class藥物，早日造福廣大患者。

       蛋白降解技術(shù)雖然熱門，但是仍然存在很多疑問，小O淺談幾點：

       1. LYTAC目前主要是大分子，如何變成小分子，怎么解決高聚合度大分子量導(dǎo)致的體內(nèi)代謝困難問題？

       2. AUTAC導(dǎo)致靶蛋白K63泛素化的機制是什么？

       3. ATTEC與LC3結(jié)合的結(jié)構(gòu)生物學(xué)基礎(chǔ)是什么？

       4. PROTAC依賴特定幾個E3泛素化連接酶的表達以及蛋白酶體介導(dǎo)的降解，如何走出局限發(fā)展新技術(shù)？